LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Biologische activiteit

In vitro

Wild-type en G2019S-transductie resulteert in een 2,5 keer hoger TR-FRET-signaal dat kan worden geremd doorLRRK2-IN-1op een dosisafhankelijke manier met IC50-waarden van respectievelijk 0,08 µM en 0,03 µM [1]. LRRK2-IN-1 bezat een IC50 van 45 nM voor remming van DCLK2 en vertoont een IC50 van meer dan 1 µM bij evaluatie in biochemische assays voor AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 en PLK1. Van LRRK2-IN-1 wordt bevestigd dat het MAPK7 remt met een EC50 van 160 nM. LRRK2-IN-1 induceert een dosisafhankelijke remming van Ser910- en Ser935-fosforylering vergezeld van verlies van 14-3-3 binding aan zowel wildtype LRRK2 als LRRK2 [G2019S] stabiel getransfecteerd in HEK293-cellen [2]. LRRK2-IN-1 is matig cytotoxisch met IC50 van 49,3 µM in HepG2-cellen. LRRK2-IN-1 vertoont genotoxiciteit in aanwezigheid en afwezigheid van S9 bij respectievelijk 15,6 en 3,9 µM [3]. LRRK2-IN-1 remt proliferatie, migratie en induceert celdood met kenmerken van apoptose van HCT116- en AsPC-1-cellen [4].

In Vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip) induceert defosforylatie van LRRK2 in de nier van de muizen [2]. Peritumorale injectie van LRRK2-IN-1 (100 mg / kg) resulteert in een significante afname van het tumorvolume en het gewicht van AsPC-1-tumorxenotransplantaten [4].

Kinase-assay

Actieve GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) en GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527) ) enzym wordt gezuiverd met glutathione sepharose uit HEK293-cellysaat 36 uur na voorbijgaande transfectie van de geschikte cDNA-constructen. Peptidekinaseassays, uitgevoerd in tweevoud, worden opgezet in een totaal volume van 40 µL met 0,5 µg LRRK2-kinase (dat bij een zuiverheid van ongeveer 10% een eindconcentratie van 8 nM oplevert) in 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 µM Nictide, 0,1 µM [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) en de aangegeven concentraties remmer opgelost in DMSO. Na 15 minuten incubatie bij 30 ° C worden de reacties beëindigd door 35 µL van het reactiemengsel op P81 fosfocellulosepapier te spotten en onder te dompelen in 50 mM fosforzuur. Monsters worden uitgebreid gewassen en de opname van [γ-32P] ATP in Nictide wordt gekwantificeerd door Cerenkov-telling. IC50-waarden worden berekend met GraphPad Prism met behulp van niet-lineaire regressieanalyse.

Cell Assay

Cellen (104 cellen per putje) worden in drievoud in een weefselkweekplaat met 96 putjes gezaaid. De cellen worden gekweekt in aanwezigheid van LRRK2-IN-1 met DMSO als drager bij 0, 0,31, 0,63, 1, 2 en 5, 10 en 20 μM. 48 uur na de behandeling wordt 10 μL TACS MTT-reagens aan elk putje toegevoegd en de cellen worden bij 37 ° C geïncubeerd totdat een donker kristallijn neerslag zichtbaar wordt in de cellen. 100 μL van 266 mM NH4OH in DMSO wordt vervolgens aan de putjes toegevoegd en 1 minuut op lage snelheid op een plaatschudapparaat geplaatst. Na schudden wordt de plaat 10 minuten beschermd tegen licht geïncubeerd en de OD550 voor elk putje wordt afgelezen met behulp van een microplaatlezer. De resultaten worden gemiddeld en berekend als een percentage van de DMSO-controle (voertuig) + / - de standaardfout van het gemiddelde.

Animal Admin

LRRK2-IN-1wordt opgelost in Captisol en toegediend door intraperitoneale injectie in wildtype mannelijke C57BL / 6-muizen met een dosis van 100 mg / kg. Controlemuizen worden geïnjecteerd met een gelijk volume Captisol. Op 1 en 2 uur tijdstippen worden muizen uitgescheiden door cervicale dislocatie en wordt nier- en hersenweefsel snel ontleed en snel ingevroren in vloeibare stikstof.

Referenties

[1]. Hermanson SB, et al. Screening op nieuwe LRRK2-remmers met behulp van een high-throughput TR-FRET cellulaire assay voor LRRK2 Ser935 fosforylatie. PLoS One. 2012; 7 (8): e43580. Epub 28 augustus 2012.

[2]. Deng, Xianming., Et al. Karakterisering van een selectieve remmer van de ziekte van Parkinson' kinase LRRK2. Nature Chemical Biology (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. Koshibu K, et al. Alternatief voor LRRK2-IN-1 voor farmacologische studies van de ziekte van Parkinson' s. Farmacologie. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N, et al. Kinase-remmer met klein molecuul LRRK2-IN-1 vertoont krachtige activiteit tegen colorectale en pancreaskanker door remming van dubbelcortine-achtig kinase 1. Mol Cancer. 6 mei 2014; 13: 103