P-nicotinamide mononucleotide (NMN) productie in Escherichia coli

Abstract

Diabetes is een chronische en progressieve ziekte met een continu toenemende prevalentie, toenemende financiële druk op de wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Onlangs werd de insulineresistentie, kenmerk van type 2 diabetes, genezen bij muizen die werden behandeld met NAD ⁺ voorloper β-nicotinamide mononucleotide (NMN) , geen toxische effecten gemeld. NMN heeft echter een hoog prijskaartje, er zijn kosteneffectievere productiemethoden nodig. Deze studie stelt een biotechnologische NMN-productiemethode voor in Escherichia coli . We tonen aan dat bicistronische expressie van recombinant nicotinamide fosforibosyl transferase (Nampt) en fosforibosyl pyrofosfaat (PRPP) synthetase in aanwezigheid van nicotinamide (NAM) en lactose een succesvolle strategie kan zijn voor kosteneffectieve NMN-productie. Eiwitexpressievectoren die het NAMPT-gen van Haemophilus ducreyi en PRPP-synthetase van Bacillus amyloliquefaciens met L135I-mutatie dragen, werden getransformeerd in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. De NMN-productie bereikte een maximum van 15,42 mg per liter bacteriekweek (of 17,26 mg per gram eiwit) in deze cellen gekweekt in PYA8-medium aangevuld met 0,1% NAM en 1% lactose.

Invoering

Volgens de Internationale Diabetes Federatie was het aantal volwassenen met diabetes type 2 in 2017 425 miljoen, en naar verwachting zal het in 2045 649 miljoen raken. Wereldwijd wordt 12% van het gezondheidszorgbudget (of $ 727 miljard) uitgegeven bij de behandeling van diabetes. Recente studies brachten insulineresistentie, het kenmerk van diabetes type 2, in verband met de afname van de mitochondriale functie en verlaagde NAD ⁺ -waarden evenals de NAD ⁺ / NADH-ratio, ook waargenomen bij veroudering. NAD ⁺ is aanwezig in alle levende organismen en is een bekend co-enzym bij oxidatiereducerende reacties. NAD ⁺ -afhankelijke eiwitdeacetylasen zoals SIRT1 en SIRT6 dienen als metabole sensoren en reguleren stroomafwaartse routes, die uiteindelijk de mitochondriale functie en insulinegevoeligheid herstellen. Deze bevinding breidt het onderzoeksdomein van NAD ⁺ -effecten uit naar andere degeneratieve ziekten geassocieerd met veroudering, zoals: cardiovasculaire, kanker, artritis, osteoporose of de ziekte van Alzheimer.

Het β-nicotinamide mononucleotide (NMN) is een tussenproduct in NAD ⁺ biosynthese geproduceerd uit nicotinamide (NAM) en fosforibosyl pyrofosfaat (PRPP) door nicotinamide fosforibosyl transferase enzym (Nampt) (EC 2.4.2.12). Omdat het goed wordt getolereerd, zonder bijwerkingen tijdens langdurige toediening bij muizen en het voorkomen van leeftijdsgebonden fysiologische achteruitgang, bleek NMN effectief te zijn bij de behandeling van door vet geïnduceerde diabetes type 2 diabetes, door mitochondriale disfunctie in verband met veroudering om te keren en te redden het effect van leeftijdsgebonden achteruitgang van neurale stamcellen.

NAM wordt meestal omgezet in NMN door enzymen die betrokken zijn bij de NAD ⁺ bergingsroutes, zoals Nampt. De werking van dit enzym vormt de belangrijkste NAD ⁺ anabole activiteit in de cel. De regulering van het nucleotidemetabolisme en de biosynthese van zoogdieren of micro-organismen vindt gewoonlijk plaats door consumptie van PRPP. PRPP is het resultaat van ribose-5-fosfaat via zowel oxidatieve als niet-oxidatieve takken van pentose-fosfaatroute.

In bacteriën wordt NAM meestal omgezet in nicotinezuur (NA) door nicotinamidase, dat is geïntegreerd in de Preiss-Handler-route, wat ook het geval is bij Escherichia col . Bij zoogdieren werd geen nicotinamidase-activiteit gerapporteerd; NAM wordt in plaats daarvan omgezet in NMN door een van de NAM fosforibosyltransferase-enzymen. Hoewel de meeste bacteriën NAM fosforibosyltransferase missen, komt het enzym tot expressie in Haemophilus ducreyi en Shewanella oneidensis .

Eenvoudige en metabolisch veelzijdige organismen, zoals Escherichia coli , worden vaak in de biotechnologie gebruikt voor gecontroleerde expressie van eiwitten met de gewenste enzymatische activiteit. Het DNA dat codeert voor dergelijke enzymen wordt vaak geïntroduceerd in bacteriën door expressievectoren zoals pET-systeem van Novagen. De pET-vectoren worden getransformeerd in bacteriën die T7-RNA-polymerase tot expressie brengen, zoals E. coli BL21 (DE3). De expressiecontrole van enzymen wordt bereikt met behulp van lac- promotor, die de expressie alleen in aanwezigheid van lactose (ook gemetaboliseerd als koolstofbron) of zijn synthetische structurele analoog, Isopropyl-1-Thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) ( niet gemetaboliseerd, met constante concentratie tijdens groeiproces). Aangezien het bacteriële metabolisme veelzijdig is, zijn de variatie van koolstofbron en concentratie van medium-gesupplementeerde enzymsubstraten sleutelfactoren om in een biotechnologisch proces rekening mee te houden.

Met als doel het huidige hoge prijsprobleem van NMN aan te pakken , stelden we in ons vorige werk een zuiveringsmethode voor van bacteriecellen. Voor verdere procesoptimalisatie, omdat we slechts één gepubliceerde gistproductiemethode konden vinden, stelt deze studie een eenvoudige en kosteneffectieve NMN biotechnologische productiemethode voor in Escherichia coli .

resultaten

Bacteriële transformatie

De uitlijning van meerdere aminozuursequenties gegenereerd voor vermeende NadV van Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 en Nampt van Mus musculus , vertoont een grote gelijkenis (Fig. S1), waardoor al deze enzymen kandidaat zijn voor een biotechnologisch proces.

Getransformeerd E. coli cellen met nadV (NAMPT) genen gedragen door pET28a (+) plasmiden vormden kolonies op de LB Agar-platen aangevuld met kanamycine. Er werden geen kolonies gedetecteerd op platen geïnoculeerd met niet-getransformeerde bacteriecellen. Agarosegelelektroforese van plasmide-DNA geïsoleerd uit deze kolonies bevestigde de aanwezigheid van Nampt-PET28a, pET28a-soNadV of pET28a-hdNadV-plasmiden in E. coli DH5α (aanvullende figuur S2A, baan 2, 3, 4). De DNA-banden kwamen overeen met de banden van E. coli BL21 (DE3) pLysS-cellen (aanvullende figuur S2A, baan 6, 7, 8), die werden getransformeerd met overeenkomstige plasmiden die rechtstreeks uit E waren geëxtraheerd. coli DH5a. In niet-getransformeerde E. coli BL21 (DE3) pLysS-cellen, gebruikt als negatieve controle, de aanwezigheid van het pLysS-plasmide werd bevestigd door elektroforese, een band die overeenkomt met de bekende lengte van 4886 bp (aanvullende figuur S2A, baan 5) werd getoond op agarosegel.

(Zie voor meer experimentele gegevens de oorspronkelijke website: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)